荧光显微镜工作原理

 荧光是物质在受到光或其他形式的电磁辐射照射时发出光能而引起的物理效应。荧光显微镜是利用荧光和磷光原位或结合反射和吸收来研究有机和无机物体的光学性质的光学显微镜。荧光显微镜有助于更清晰地观察物体的亚细胞和内部结构。它是在 20 世纪初由 August Köhler、Carl Reichert 和 Heinrich Lehmann 发现的。

文章索引（点击跳转）

• 荧光显微镜工作原理

• 荧光显微镜的工作

• 荧光显微镜的组成

• 1. 荧光团

• 2. 光源

• 3. 励磁滤波器

• 4.分色镜

• 5. 排放过滤器

• 荧光显微镜的优点

• 荧光显微镜的缺点

• 荧光显微镜的用途

荧光显微镜工作原理

荧光显微镜的工作原理通常是用染料对样品的成分和结构进行染色。这是因为大多数细胞成分本质上是无色的。因此，它们不能容易地相互区分。用短波长光或电磁射线照射的荧光团或荧光分子倾向于发光。与入射光相比，发射光具有更长的波长。通常，辐照和发射之间的持续时间以纳秒为单位，可以很容易地忽略。发射的光与入射光分开，这告诉了荧光团的确切位置。样品的图像是基于二次光而不是基于一次入射光产生的。

荧光显微镜的工作

荧光显微镜的工作方式与光学显微镜类似。它由强光源、特殊带通滤光片和样品的荧光标记组成。待研究的样品置于显微镜下。使波长短到足以激发荧光团的光线照射到样品上。在物镜的帮助下，这道光线聚焦在样本上。样品发出的激发射线然后通过物镜聚焦在探测器上。激发光线的主要部分通过样品物体传输，而其中一部分被反射回来并到达检测器。

荧光显微镜的组成

1. 荧光团

荧光团是一种在被电磁波或光波激发时能够发光的化合物。它也被称为荧光染料。荧光团基本上由具有各种 π 键的芳香基团或平面/环状分子的组合组成。

2. 光源

光源是荧光显微镜最重要的组成部分之一。在这里，用于激发的最常见光源包括激光器、大功率 LED、氙弧灯、汞蒸气灯等。

3. 励磁滤波器

荧光显微镜中使用的激发滤光片通常是带通滤光片，它允许落入特定带宽的信号同时拒绝所有其他信号。荧光团吸收的波长很容易通过，而反射的光辐射则被阻挡。

4.分色镜

分色镜充当薄膜滤光片。分色镜的主要用途是选择性地通过小范围颜色的光，同时反射所有其他颜色。它也被称为精确的彩色滤光片。

5. 排放过滤器

发射滤光片是一种带通滤光片。发射滤光片的工作类似于激发滤光片。它通过荧光团发射的光辐射，同时阻挡激发光。 

荧光显微镜的优点

1. 荧光显微镜的灵敏度非常高，即每立方微米大约等于 50 个分子。

2. 借助荧光显微镜，可以将不同的分子染上不同的颜色，从而使用户可以同时对一种物质的多个分子进行成像。

3.荧光显微镜比传统光学显微镜效率更高。

4. 可用于体内和体外成像。

5. 荧光显微镜能够以高精度分离单个蛋白质。

6. 荧光显微镜最适合成像和研究活细胞表现出的动态行为。

7. 荧光显微镜能够产生高分辨率和清晰的图像，从而加强研究。

8. 它结合了光学显微镜的放大特性和荧光的可视化。

9. 荧光显微镜可用于生成正在研究的样品的 3D 放大图像。

荧光显微镜的缺点

1. 由于称为光漂白的过程，荧光显微镜中存在的荧光化合物或荧光团在受到激发时往往会随着时间的推移失去其发光能力。当荧光团分子由于荧光期间的电子激发而受到化学损伤时，通常会发生光漂白。

2. 它只允许观察和研究样品中已经突出显示并标记为荧光的某些结构。

3. 当荧光材料被光线照射时，荧光分子往往会产生化学物质，从而进一步导致光毒性。这种光毒性效应破坏了观察样品的原始性质。短波长光辐射的光毒性相对较高。

4. 荧光显微镜无法提供有关脂质双层的信息，尤其是对于 SUV。

5. 荧光显微镜不能产生任何与囊泡的双层特征或层状有关的结论性观察结果。

6. 探针和染料的添加往往会干扰脂质囊泡的性质，从而导致数据解释不准确，从而破坏实验的真实性。

7. 光诱导的脂质过氧化可能导致结构域形成。

荧光显微镜的用途

1. 荧光显微镜广泛用于在微观水平上以最高质量研究样品的内部结构。

2. 荧光显微镜最适合研究活体生物样本。

3. 在标记细胞或微生物的最内部结构时，通常首选这种显微镜。

4.有助于测量细胞或被观察样品的生理状态。