你准备好创作一件艺术品吗？

固定细胞成像技巧

你准备好从你的免疫荧光实验中创建令人大开眼界和可发表的图像吗？了解免疫荧光方案的基本步骤将帮助您生成**能传达数据的图像，这些提示可以使图像成为一件艺术品。

不幸的是，没有一种**的染色固定细胞方案，因此需要优化新抗体的方案。从长远来看，找到有关哪些条件与抗体 - 抗原组合良好协作的信息可能会有很大帮助。一点点的前期文献搜索是值得的，它节省了令人惊叹的图像。

染色细胞用于成像有六个基本步骤：样品制备，固定，透化，阻断，抗体孵育和安装。以下是一些有助于优化每个步骤结果的提示。

1.样品制备

必须具备正确培养基，血清，温度和CO2浓度的孵育条件。另外请记住您正在生长它们的基材以及它对您的成像平台的作用。通常，这意味着在培养皿或培养皿中涂覆的盖玻片上培养细胞，但它也可能意味着在多孔板，悬浮液瓶中或3D细胞培养物中生长。直立式显微镜通常需要盖玻片上的细胞，而倒置系统也可以在多孔板或培养皿中成像细胞。

在开始免疫荧光方案之前，请始终检查细胞的一般健康状况和融合情况。你有足够的细胞吗？它们是否具有预期的形态，或者它们是否起泡，变圆或从基材上脱落？

提示＃1 - 在开始优化成像之前，要知道您的细胞表达抗体的抗原。  这似乎很简单，但你会惊讶于许多研究人员在跳转到抗体 - 抗原组合的免疫荧光染色之前忘记做一个简单的蛋白质印迹。

提示＃2 - 优化缓冲区。经常被忽视的优化领域之一是缓冲区选择。在固定和透化后的孵育和洗涤期间使用缓冲液; 使用正确的缓冲区可以对信号强度产生很大影响。大多数科学家自动转向PBS以满足其染色需求，但pHEM或CSK等缓冲液（通常在较低pH值下使用）可能对细胞骨架或细胞质抗原有帮助。

2.固定。

通过所有这些孵化和洗涤尽可能保持细胞完整是既棘手又极其重要的。固定是维持细胞结构的关键步骤。许多商业销售的一抗已经用特定的固定剂验证，但是新抗体需要建立优化的方案。

有两类固定剂可供选择：醛固定剂和有机溶剂。醛固定在细胞骨架和膜内使蛋白质彼此交联，因此是在这些结构中标记抗原的选择方法。然而，这种方法化学修饰蛋白质并且可以掩盖它们，使得检测更加困难。一个很好的起点是基于甲醛的Image-iT®固定/渗透稳定试剂盒，适用于大多数细胞类型。有机溶剂，如甲醇，乙醇和丙酮，不会通过交联改变蛋白质，但它们会使蛋白质变性和沉淀。这种方法可能对那些具有“埋藏”抗原的抗体有益，例如在细胞核中。

提示＃3-不要使用有机溶剂来固定含有荧光蛋白标签的细胞。   这可能使您标记的融合蛋白变性，使您无信号。

提示＃4 - 反作用固定剂诱导的自发荧光。  一些样品易于发生固定诱导的自发荧光，这可以通过用10mM的BH 4或NH 3 Cl 还原醛基来减轻。戊二醛对自发荧光特别不利。

提示＃5 - 可能需要抗原检索方法。  如果抗原被掩蔽，例如通过醛交联，则通常可以通过用热，压力和/或特殊缓冲液（例如柠檬酸盐缓冲液）处理来掩盖抗原。已经公布了对这些方法的大量评论，并且有时商业抗体来源将推荐一种方法。

3.渗透性

透化有助于通过脱脂膜使抗体通过细胞膜和固定细胞内部。有许多不同的洗涤剂可用于透化细胞，包括NP-40，Triton X-100，Tween-20和皂苷。

所需的透化程度取决于抗原的位置和所需的外显深度。例如，如果您感兴趣的蛋白质位于细胞表面或细胞外基质中，那么您可能不需要太多透化，如果有的话。事实上，你可以通过这个程序去除膜，从而失去膜结合蛋白。然而，细胞间靶标需要一些透化方法以使抗体到达抗原。需要优化时间和浓度，但一个很好的起点是基于TritonX-100的Image-iT®固定/渗透稳定试剂盒。

提示＃6-优化固定和透化方法。通过在不同的时间和浓度尝试不同的化合物来做到这一点。您正在寻找良好的细胞或组织形态和强烈的特定染色。文献检索有时也可以证明是有用的。

4.阻止

由于非特异性蛋白质结合，通过阻断抗体与样品的非特异性结合，可以改善任何免疫荧光染色。牛血清白蛋白和热灭活的正常血清可用作非特异性阻断剂，并且还有一些可用于此目的的商业产品，例如BlockAid TM阻断溶液。在抗体孵育之前以及在一抗孵育溶液中施加封闭溶液。

提示＃7-仔细选择阻断剂。  不要使用与产生一抗的物种相同的血清。什么都不会摆脱那个背景！

提示＃8-可能需要额外的阻塞解决方案。  使用Image-iT FX信号增强器可以阻止由染料电荷引起的非特异性结合。专门的方法，如酶促或生物素 - 抗生物素蛋白扩增，也需要阻断一些细胞和组织中常见的内源性过氧化物酶，磷酸酶或生物素。

5.抗体孵育

实际的检测步骤包括用**抗体和染料缀合的第二抗体沐浴细胞或组织。同样，必须仔细优化**终浓度和孵育时间，但是对于培养细胞的显微镜检查，通常在室温下在0.5-10μg/ mL的范围内持续30-60分钟。多个一抗也可以在一个步骤中组合。 

通常用针对一抗的宿主物种的染料缀合的二抗检测一抗。当组合多种一抗时，确保不同的二级抗体与其他物种交叉吸附，否则它们会交叉标记，导致信号混乱。确保使用的染料与显微镜可用的过滤器选项和/或激光线匹配，并且是具有明亮和光稳定性的染料，例如Alexa Fluor染料。

提示＃9-为您的目标使用**好的一抗。这是该过程中**重要的部分之一。如果做得好，您将获得明亮，特定的污渍准备出版。**的抗体将具有良好的亲和力和特异性。值得研究和支付**好的抗体。如果生成自己的，请花时间设计抗体。从长远来看，它会得到回报。确保它不老和退化！

提示＃10-使用适当的控件。您将需要非初级（仅次级）对照来测试二抗的特异性。没有抗体或染料的对照也将测试自发荧光。如果使用多种一抗，则进行单抗体对照以测试交叉标记。

5.安装

如果您的染料之后不稳定，那么通过所有这些步骤和优化的重点是什么？一旦**终洗涤完成，标记的样品将需要处于**佳保留染料信号的成像环境中。虽然细胞可以在缓冲液或缓冲液/甘油溶液中成像，但**好的选择是将细胞置于防褪色安装介质中，这将保留初始信号并减少光漂白（由于曝光而变暗）并且具有足够高的折射率实现**的分辨率。

提示＃11-选择**适合您成像时间线的防褪色剂。  如果您立即成像然后丢弃幻灯片，您的封固剂可以保持液态，例如SlowFade（R）Diamond。但是，如果您希望将幻灯片存档**或更长时间并在以后拍摄图像，则需要使用硬化或“固化”的固定剂，例如ProLong（R）Diamond。